如何进行DNA甲基化分析
基因甲基化的检测方法主要有以下几种：
甲基化特异性的PCR(Methylation-specific PCR，MSP)
用亚硫酸氢盐处理基因组DNA，所有未发生甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变；随后设计针对甲基化和非甲基化序列的引物进行PCR。通过电泳检测MSP扩增产物，如果用针对处理后甲基化DNA链的引物能得到扩增片段，则说明该位点存在甲基化；反之，说明被检测的位点不存在甲基化。
2、亚硫酸氢盐测序法(Bisulfite sequencing PCR，BSP)
用亚硫酸氢盐处理基因组DNA，则未发生甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变。随后设计BSP引物进行PCR，在扩增过程中尿嘧啶全部转化为胸腺嘧啶，最后对PCR产物进行测序就可以判断CpG位点是否发生甲基化称为BSP-直接测序方法。将PCR产物克隆至载体后进行测序，可以提高测序成功率，这种方法称为BSP-克隆测序法。
3、甲基化敏感扩增多态性
(Methylation-Sensitive Amplified Polymorphism,MSAP)
MSAP是利用对DNA甲基化敏感的两种同裂酶Hpa II和Msp I来对基因组DNA进行酶切和连接。由于两种酶能够识别相同的限制性酶切位点，即CCGG位点。当DNA序列中的CCGG位点出现不同程度的甲基化状态时，会分别被这两种酶识别，以有无产物的方式体现出来。
4、焦磷酸测序(Pyrosequencing)
通过准确定量单个连续的CpG 位点上的甲基化频率，焦磷酸测序能检测并定量甲基化水平上的细微改变。在序列延伸过程中，根据C和T的掺入量来定量确定单个位点的C-T比例。因此，不同位点的甲基化变异就能被准确检测。由于焦磷酸测序提供了真实的序列数据，甲基化状态也就以序列形式呈现。
如何进行DNA甲基化分析
DNA甲基化是最早发现的基因表观修饰方式之一，真核生物中的甲基化仅发生于胞嘧啶，即在DNA甲基化转移酶（DNMTs）的作用下使CpG二核苷酸5’-端的胞嘧啶转变为5’-甲基胞嘧啶。DNA甲基化通常抑制基因表达，去甲基化则诱导了基因的重新活化和表达。这种DNA修饰方式在不改变基因序列前提下实现对基因表达的调控。脊椎动物DNA的甲基化状态与生长发育调控密切相关，比如在肿瘤发生时，抑癌基因CpG岛以外的CpG序列非甲基化程度增加，CpG岛中的CpG则呈高度甲基化状态，导致抑癌基因表达的下降。
1、甲基化特异性的PCR（Methylation-specific PCR，MSP）
用亚硫酸氢盐处理基因组DNA，所有未发生甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变；随后设计针对甲基化和非甲基化序列的引物进行PCR。通过电泳检测MSP扩增产物，如果用针对处理后甲基化DNA链的引物能得到扩增片段，则说明该位点存在甲基化；反之，说明被检测的位点不存在甲基化。
2、亚硫酸氢盐测序法（Bisulfite sequencing PCR，BSP）
用亚硫酸氢盐处理基因组DNA，则未发生甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变。随后设计BSP引物进行PCR，在扩增过程中尿嘧啶全部转化为胸腺嘧啶，最后对PCR产物进行测序就可以判断CpG位点是否发生甲基化称为BSP-直接测序方法。将PCR产物克隆至载体后进行测序，可以提高测序成功率，这种方法称为BSP-克隆测序法。
3、高分辨率熔解曲线法（High Resolution Melting，HRM）
在非CpG岛位置设计一对针对亚硫酸氢盐修饰后的DNA双链的引物，这对引物中间的片段包含感兴趣的CpG岛。若这些CpG岛发生了甲基化，用亚硫酸氢盐处理后，未甲基化的胞嘧啶经PCR扩增后转变成胸腺嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变，样品中的GC含量发生改变，从而导致熔解温度的变化（图1）。
其中，样品要求：细胞（≥106 个）、组织（≥300mg）、血液（≥1ml）、血清（≥1.5ml）等样品材料，基因组DNA（体积≥20μl，浓度≥50 ng/μl）。
与dna甲基化不相关的基因
DNA甲基化是一种最常见的表观遗传现象。一般起到抑制基因表达的作用甲基化的DNA主要分布于真核生物基因组的非编码区，DNA 甲基转移酶的作用下，在DNA分子的碱基上添加甲基，一般是在胞嘧啶核苷的嘧啶环5位上进行甲基化，即5-甲基胞嘧啶(5-mC)。当然也存在其他位置的甲基化。5-甲基胞嘧啶；N6-甲基腺嘌呤；7-甲基鸟嘌呤DNA及组蛋白的甲基化是非活性状态染色质的特征。真核生物中，5-甲基胞嘧啶主要出现在CpG二核苷酸序列上，由于CpG通常成串出现在DNA中，长度一般为1-2kb，所以这段序列被称为CpG岛。CpG岛主要位于基因的启动子区附近，表达量高的基因启动子附近的CpG岛通常不会甲基化。 研究表明，CpG 岛的甲基化一般与基因沉默相关联；而非甲基化一般与基因活化相关联。DNA 甲基化抑制基因表达的机理DNA甲基化会引起DNA的构象发生变化，影响蛋白与DNA的相互作用，从而导致转录因子无法结合或者结合效率下降，从而达到抑制基因表达。从另一方面，DNA甲基化同样有识别甲基化的蛋白会和甲基化的DNA结合，进一步使转录因子无法正常结合。DNA甲基化会导致染色体失活在一些生物中存在剂量补偿效应（会有另一篇专栏介绍这个效应），染色体会通过DNA的甲基化等一些方式进行失活。比如哺乳动物的X染色体的X失活中心的失活基因Xist会发生甲基化。本文禁止转载或摘编生物考研分子生物学生物化学展开阅读全文33分享推荐文章Ron Lemen 画出运动中的身体学习 · 49阅读利用XFLR5进行无人机气动数据分析学习 · 226阅读直播回放 | 无人机集群建模与分析学习 · 73阅读加载中...打开bilibili，查看全部评论打开App
DNA的甲基化可以遗传么
DNA的甲基化可以遗传
DNA甲基化与遗传印记、胚胎发育
DNA甲基化在维持正常细胞功能、遗传印记、胚胎发育过程中起着极其重要的作用。研究表明胚胎的正常发育得益于基因组DNA适当的甲基化。例如：缺少任何一种甲基转移酶对小鼠胚胎的发育都是致死性的。此外，等位基因的抑制(allelic repression)被印记控制区(imprinting control regions, ICRs)所调控,该区域在双亲中的一个等位基因是甲基化的。印记基因的异常表达可以引发伴有突变和表型缺陷的多种人类疾病。
2 DNA甲基化与肿瘤
甲基化状态的改变是引起肿瘤的一个重要因素,这种变化包括基因组整体甲基化水平降低和CpG岛局部甲基化水平的异常升高,从而导致基因组的不稳定(如染色体的不稳定、可移动遗传因子的激活、原癌基因的表达)和抑癌基因的不表达。如果抑癌基因中有活性的等位基因失活，则发生癌症的机率提高,例如：胰岛素样生长因子-2（IGF-2）基因印记丢失导致多种肿瘤,如。
目前肿瘤甲基化的研究主要集中在抑癌基因。这是因为人们发现肿瘤的发生可能与抑癌基因启动子区的CpG岛甲基化造成抑癌基因关闭有关。由于CpG岛的局部高度甲基化早于细胞的恶性增生，因此甲基化的诊断可以用于肿瘤发生的早期预测，而且全基因组的低甲基化也随着肿瘤发生而出现，并且其随着肿瘤恶性度的增加而显著，因此甲基化的检测可用于肿瘤的分级。
