防御素

防御素的五、防御素的应用

1、防御素与口腔黏膜疾病的关系作为机体天然免疫的重要组成部分，防御素家族在口腔黏膜宿主防御及免疫应答过程中发挥着重要作用，与多种口腔黏膜疾病（口腔溃疡、扁平苔藓、白斑及口腔念珠菌病等）关系密切。现今关于这方面的研究尚处于起步阶段，主要以体外实验为主，其作用机制也多为推测，而有关防御素在体内的具体作用、有无毒性或其他不良反应等方面的研究甚少，还需进一步全面多层次的研究探讨，以阐明防御素在口腔黏膜疾病发生发展过程中的具体作用及其机制，为口腔黏膜疾病防治提供新的策略。2、防御素与炎症性肠病的关系克罗恩病（CD）是一种严重的肠道慢性炎症性疾病，病变部位可发生于消化道的任何部位，病变形式多样，其发病是遗传因素与环境因素共同作用的结果。肠道防御素是机体抵御外源性致病因子的重要屏障，而克罗恩病患者肠道防御素表达水平却存在着较大差异。回肠段病变的克罗恩病患者，回肠潘氏细胞防御素HD-5、HD-6 的表达较正常人和非回肠段病变克罗恩病患者明显降低，这种变化与 NOD2（nucleotide oligomerization domain）基因突变密切相关；结肠组织活检发现无 NOD2 基因突变的克罗恩病患者结肠组织HD-5、HD-6 的表达水平反而增高，而 HD-5、HD-6 水平降低将影响肠道黏膜的天然屏障作用，导致黏膜细菌附着引发进一步损害。以往认为溃疡性结肠炎（UC）在欧美国家比较多见，但近年来中国文献报道的病例数也显著增多。UC 病变主要累及结肠，正常人结肠黏膜很少表达 HD-5 和 HD-6，而UC 患者结肠上皮细胞中 HD-5 和 HD-6 mRNA 的表达水平显著高于正常人，且 HD-6 的表达还具有特异性，即在非感染性的结肠炎组织中表达并不明显。HBD-1 在肠道上皮细胞呈持续性表达，且不受外界因子影响，具有基础防御功能。但应用实时 PCR 技术检测发现 UC 和克罗恩病结肠黏膜组织 HBD-1 基因表达水平均有所降低，这将可能促使肠道黏膜抗菌活性下降，从而导致细菌入侵机体引发炎症反应。在 UC 患者的病变结肠组织中，HBD-2 可被诱导性表达，而 HBD-3 的表达水平和 HBD-2 存在一定的相关性，其在 UC 时表达亦有明显增加。此外，HBD-4 mRNA的表达水平在 UC 肠上皮细胞中也明显增高。3、防御素与慢性阻塞性肺部疾病的关系慢性阻塞性肺部疾病（COPD）是一种以气道受限为特征的慢性气道炎症性疾病，患病率及病死率均较高，其中呼吸道感染是COPD 发病及加剧的一个重要因素。HBD-2 与呼吸系统疾病关系紧密，在肺部黏膜防御中具有重要作用。研究证实，HBD-2 的产生或作用被抑制后，机体将发生肺部感染[7]，据此推测人为补充外源性防御素可能会阻止细菌的定植和感染的发生。已有研究证实，重组 HBD-2 对肺损伤具有保护作用，可减少绿脓杆菌感染大鼠肺组织的菌落数[8]。COPD 患者存在气道、肺实质和肺血管炎症，而肺上皮细胞中高表达的 HBD-2 能通过对肺部炎症因子的调节，阻止全身性炎症反应（SIRS）甚至多器官功能衰竭（MODS）的发生发展。此外，重组 HBD-2 还可调控脓毒症诱发的肺组织细胞的过度凋亡，从而减轻肺组织损伤，保护肺功能。4、防御素的临床药用研究防御素抗菌谱广泛，作用机理特殊，微生物不宜产生抗药性，因此具有很大的药用潜力。2008年，全球首个防御素药物（PMX-30063）在加拿大完成一期临床试验，其对十余种耐药菌效果显著。针对金黄色葡萄球菌引起的急性细菌性皮肤感染这一适应症目前已经完成Ⅱ期临床研究。它通过直接靶向细菌细胞膜而达到杀菌的目的，不产生耐药性，从而有望解决日渐增多的细菌耐药性问题。 防御素在农业中可用于农作物抗病育种研究，该研究主要是寄希望建立防御素生物反应器，大量生产并提纯防御素蛋白，以便培育抗性新品种。已有研究者将兔防御素 NP-1转入小麦植株，田间抗病虫鉴定结果显示小麦对于白粉病、叶锈和条锈病的抗性均有较大提高。而将兔防御素 NP-1基因构建至植物表达载体中获得转基因番茄植株的抗病实验结果表明，其对番茄青枯病具有抗性，为番茄的抗病育种工作奠定了基础。

防御素的三、防御素的分类

防御素是动物体内防御系统的主要成分,大多由29～42个氨基酸残基组成,含3对分子内二硫键,相对分子质量为2～6ku,根据其二硫键位置的不同可分为α-防御素、β-防御素、θ-防御素3类。α-防御素是于1980年美国Lehrer实验室从兔肺巨噬细胞中首先分离得到的、阳离子性极强的小分子抗菌肽,称为defensin,后被归为α-防御素；主要分布于人、兔、猪、鼠类的嗜中性粒细胞、兔子的齿槽巨嗜细胞及人类和啮齿动物的小肠潘氏细胞。α-防御素分子链内二硫键的连接位置分别为Cys1-Cys6、Cys2-Cys4、Cys3-Cys5。其中Cys1-Cys6连接N端和C端,形成分子大环。β-防御素是Diamond等(1991)首先在牛的气管黏膜上皮细胞中发现的,后又在牛粒性白细胞中发现了13 种与其序列高度相似, 但其共有序与α-防御素不同,故被命名为β-防御素；主要分布于牛的骨髓和人及多种动物(牛、羊、猪、骆驼、驯鹿、小鼠、大鼠)的胃肠道、呼吸道、舌、牙龈、肾、皮肤的上皮中,近来在梅花鹿舌粘膜的上皮细胞内也发现了该短肽。单核细胞和巨噬细胞通常缺乏防御素,但是他们可以释放诱导上皮细胞合成β-防御素的信使。β-防御素分子链内二硫键的连接位置分别为Cys1-Cys5、Cys2- Cys4、Cys3-Cys6。θ-防御素是于2002年Trabi等用反向高效液相层析色谱法从猕猴的白细胞中分离出来的1种成环状结构分子,又被称为猕猴θ型防御素-1(RTD-1),主要分布于巨嗜细胞内。θ-防御素的结构不同于α和β-防御素,其前体(已经发现3种)是α-防御素类似物,由1个终止密码子从α-防御素3个半胱氨酸碳骨架的第4个残基处截断,从截短的α-防御素前体切掉1个 9个氨基酸 的片段,然后从头到尾进行剪切,直到其他的相同或相似的九肽出现。成熟的θ-防御素是2个半防御素的修饰与结合的产物,它的前体(称之为半防御素)是变异的α-防御素基因和1个未成熟的终止密码子的编码产物,导致每1个前体仅仅包含3个半胱氨酸残基。θ-防御素分子链内二硫键的连接位置分别为Cys1-Cys4、Cys2-Cys5、Cys3-Cys6,连接形成环状结构。 防御素能有效杀灭革兰阴性细菌和革兰阳性细菌。在体外浓度为 10～100 mg/L 的防御素即对多种细菌具有杀伤作用，而防御素在中性粒细胞中的浓度为 g/L 级，远远超过上述数值，这表明在体内防御素可能具有更强的杀菌活性，目前研究发现防御素对革兰阳性细菌的杀伤能力明显要强于革兰阴性细菌。在体外，HBD-2 对大肠杆菌的半数致死量（LD50）为 0.46nmol/ml，最小抑菌浓度（MIC）为 15 μg/ml，而对绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌的 MIC 为62 μg/ml。体外实验证明大多数防御素的 MIC 范围为0.5-10 μmol/L 。对于防御素抗菌活性机制,大部分研究者认为主要和微生物的细胞膜结构有关。防御素发挥抗菌作用可分为三个阶段:(1)由静电吸引。防御素与靶细胞膜结合。防御素带正电荷,可通过静电作用与带负电荷的细菌膜脂层结合；(2)通道形成。带正电荷的防御素分子或其多聚体则与细菌质膜上带负电荷的磷脂头部和水分子相互作用,显著地增加生物膜的通透性。防御素作用于膜上形成稳定的多个通道；(3)内容物外泄。通道形成后,防御素进入细胞内的同时,其他胞外分子也伴随进入(如肽、蛋白质或无机离子),而靶细胞的重要物质(如盐离子和大分子)渗出，致使靶细胞发生不可逆损伤而死亡。防御素还能通过诱导细胞因子的释放和介导非成熟性的树突状细胞协同刺激分子的表达上调,促进IDC 的成熟,进而活化T 细胞,触发特异性免疫应答。 防御素能杀灭一些被膜病毒，如 HIV、疱疹病毒、水泡型口炎病毒，但对无衣壳病毒却无效。θ-防御素还具有抗滤过性病原体和抗毒素作用。体内实验显示，防御素可延缓或根除兔梅毒病，并使兔牙周炎龈下菌群恢复正常。防御素主要通过与病毒外壳蛋白结合从而导致病毒丧失生物活性，这一特殊作用机理也使得微生物不易对其产生抵抗性。防御素可直接抑制病毒，对病毒的抑制程度依赖于防御素浓度以及分子内二硫键的紧密程度，其抗病毒功效同样受时间、pH 值、离子强度和温度等因素的影响，在中性及低离子强度条件下，防御素具有较强的抗病毒活性 ，而在实验体系中加入血清或血清蛋白则可大大削弱防御素的抗病毒功效。有关防御素的抗病毒作用机理，大体上可以总结为如下三点：1、闭门羹---- 阻止病毒入侵宿主细胞许多细胞和病毒的外膜分子是糖蛋白，它们就像刷子一样突起（见图一）。 病毒感染细胞采用“两步走”政策：首先，病毒的外衣即包膜死缠烂打地粘着到细胞的外膜上；接着，病毒包膜与细胞膜融合在一起。两个膜融合后，病毒就将它的遗传物质插入到细胞中。　　防御素则斜插在糖蛋白上以防病毒向细胞糖蛋白的扩散（见图二），让病毒吃个“闭门羹”无法进入细胞。没能进入细胞的病毒接着会被免疫系统的细胞摧毁。 2、突破口----杀灭病毒防御素通常带多个正的净电荷，而病毒囊膜及其表面糖蛋白通常带负电。这使得防御素像一块块小磁铁，吸附到病毒囊膜带负电荷的糖蛋白上。这样便使囊膜病毒穿孔，形成突破口，内容物外泄而死亡。 3、地雷阵----阻止病毒基因复制与转录万一病毒进入细胞内，防御素可以与细胞膜表面促肾上腺皮质激素 (ACTH)，人硫酸肝素糖蛋白（HSPG），低密度脂蛋白受体（LDLR）等相结合，从而启动G蛋白偶联型受体的级联放大反应，进一步激活磷酸激酶C。这些细胞信使作用就像埋伏在胞内的地雷，可以阻止整合到宿主基因组之前的病毒复合体进入细胞核或者阻止病毒的基因转录。整合不到宿主基因组的病毒随后被摧毁。 防御素不仅可以直接抵抗病原微生物，而且还具有免疫调节作用。防御素通过细胞信号传递的作用，增强非特异性免疫细胞，尤其是巨噬细胞的活性和趋化性。防御素还可以促进机体T细胞的趋化和增殖，增强机体免疫应答能力，调节特异性免疫，增强生物机体主动防御功能。防御素能够作为一种效应分子激活巨噬细胞、DC、气管上皮细胞等细胞表面受体从而启动获得性免疫系统，并将先天性免疫和获得性免疫有机连接。现已证明一些 α-防御素、β-防御素对 T 细胞、单核细胞以及未成熟的 DC 具有趋化活性，可诱导单核细胞和上皮细胞产生细胞因子。人、鼠、猪、兔的中性粒细胞防御素可以诱导肥大细胞脱颗粒并释放组胺。β-防御素还能通过与人趋化因子受体6（CCR6）结合，从而吸引不成熟的树突状细胞（DC）和记忆T细胞（Tm）至炎症部位，激活细胞免疫和体液免疫。此外，防御素还可以直接促进感染部位中性粒细胞的补充和积聚。

防御素的二、防御素研究背景

1966年，美国科学家Zeya和Spitznagel首次在哺乳动物老鼠和豚鼠的多形核嗜中性白细胞中发现一类具有抗菌活性的碱性多肽，将其称之为“溶酶体阳离子蛋白”。这就是后来人们称之为防御素的物质。到目前，人们已经鉴定了四百余种防御素。1985年，美国加州大学Robert Lehrer博士首次命名防御素（defensins），并报道了兔防御素MCP-1 及MCP-2对流感病毒和单纯疱疹病毒具有直接中和灭活作用。次年，该研究组还报道了人体内三种alpha防御素 (Humanα-defensin或human neutrophil peptide, HNP)对流感病毒、巨细胞病毒、水泡性口炎病毒等均有中和作用。2002年，美国洛克菲勒大学艾伦·戴蒙德艾滋病研究中心的华人科学家张林琦在《SCIENCE》杂志上发表文章，报道人体内抑制艾滋病病毒复制的物质是T淋巴细胞分泌的α-防御素，这个发现为艾滋病的控制与治疗提供了新的思路与方向，引起生物医学界的广泛关注。2003年开始，和仕康公司的核心研发人员在构建海洋生物海马等物种的cDNA文库时发现了大量防御素基因，并分离到五种天然防御素。2007年开始，他们依托南海海洋生物技术国家工程中心等科研转化平台将防御素发酵制剂作为饲料添加剂进行大量动物实验，结果表明该制剂可显著提升动物免疫力和防病抗病水平。